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オンサイト機能を備えたラボオンチップシステムは、迅速かつ正確な診断の可能性を提供し、生物医学機器や訓練を受けた専門家が利用できないリソースに制約のある環境で役立ちます。しかし、多機能の分注、オンデマンド放出、信頼性の高い性能、試薬の長期保管に必要なすべての機能を同時に備えたポイントオブケア検査システムを構築することは、依然として大きな課題です。ここでは、流体を任意の方向に操作し、加えられた空気圧に対して正確かつ比例した応答を提供し、突然の動きや振動に対して安定性を維持できる、レバー作動のマイクロトラベルスイッチ技術について説明します。この技術に基づいて、試薬の導入、混合、反応機能をすべて 1 つのプロセスに統合するポリメラーゼ連鎖反応システムの開発についても説明します。これにより、18 人の患者からのすべての臨床鼻サンプルに対して「サンプルインアンサーアウト」のパフォーマンスが達成されます。インフルエンザと 18 の個別の対照。蛍光強度は標準ポリメラーゼ連鎖反応とよく一致しています (ピアソン係数 > 0.9)。この技術に基づいて、試薬の導入、混合、反応機能をすべて 1 つのプロセスに統合し、18 人の患者からのすべての臨床鼻サンプルに対して「サンプルインアンサーアウト」のパフォーマンスを達成するポリメラーゼ連鎖反応システムの開発についても説明します。インフルエンザと 18 の個別の対照を使用した結果、蛍光強度は標準的なポリメラーゼ連鎖反応とよく一致しました (ピアソン係数 > 0.9)。Основываясь на этой технологии, мы также описываем разработку системы полимеразной цепной реакции, которая объединя ет функции введения реагентов, смезивания и реакции в одном процессе, что обеспечивает выполнение «образец-в-ответ-вы ход» для всех клинических образцов из носа от 18 пациентов с Грипп и 18 отдельных контролей, в хоролем соответствии интенсивности флуоресценции со стандартной полимеразной цепной цией (коэффициенты Пирсона> 0,9)。この技術に基づいて、注入、混合、反応の機能を 1 つのプロセスで組み合わせ、18 人のインフルエンザ患者からのすべての臨床鼻検体のサンプルインレスポンスアウトを可能にするポリメラーゼ連鎖反応システムの開発についても説明します。および 18 個の個別のコントロールは、標準的なポリメラーゼ連鎖反応の蛍光強度とよく一致しています (ピアソン係数 > 0.9)。この技術に基づいて、試薬の注入、混合、および反応機能を統合して、18 個のサンプル内鼻患者検体からすべての臨床鼻検体を分析するポリメラーゼ連鎖反応システムの開発についても説明します。インフルエンザと 18 個の個別対照、蛍光強度が一致しました。標準的なポリメラーゼ連鎖反応と良好に一致します (ピアソン係数 > 0.9)。提案されたプラットフォームは、生物医学分析の信頼性の高い自動化を保証するため、さまざまなポイントオブケア検査装置の商品化を加速できます。
何百万人もの命を奪った2020年の新型コロナウイルス感染症パンデミックのような、新たな人類の病気は、世界の健康と人類の文明に深刻な脅威をもたらしています1。病気の早期、迅速かつ正確な検出は、ウイルスの蔓延を制御し、治療結果を向上させるために重要です。検査サンプルが病院や診断診療所に送られ、専門家によって運営される集中検査室をベースとした中核的な診断エコシステムは、現在、世界中で約 58 億人、特に資源が限られた環境で生活している人々のアクセスを制限しています。高価な生物医学機器や資格のある専門家が不足している場合。臨床医 2. したがって、情報に基づいた診断決定を行うためのタイムリーな診断情報を臨床医に提供できる、ポイントオブケア検査 (POCT) 機能を備えた、安価で使いやすいラボオンチップ システムの開発が緊急に必要とされています。 。そして治療3。
世界保健機関 (WHO) のガイドラインでは、理想的な POCT は、手頃な価格で、使いやすく (最小限のトレーニングで使いやすい)、正確 (偽陰性や偽陽性を避ける)、高速で信頼性が高く (良好な再現性特性を提供する)、成果物（長期保管が可能で、エンドユーザーがすぐに利用できる）4.これらの要件を満たすために、POCT システムは次の機能を提供する必要があります。手動介入を減らすための多用途の投与、正確な検査結果を得るために試薬輸送をスケールするためのオンデマンド放出、および環境振動に耐える信頼性の高い性能です。現在、最も広く使用されている POCT デバイスは、数層の多孔質ニトロセルロース膜で構成されるラテラル フロー ストリップ 5,6 で、非常に少量のサンプルを前方に押し出し、毛細管力によってあらかじめ固定化された試薬と反応します。フローストリップベースの POCT デバイスは、低コスト、使いやすさ、迅速な結果という利点がありますが、多段階分析を必要としない生物学的検査 (例: グルコース検査 7,8 や妊娠検査 9,10) にのみ使用できます。反応（例：複数の試薬の装填、混合、多重化）。さらに、流体の動きを制御する駆動力（毛細管力）は、特にバッチ間で良好な一貫性をもたらさないため、再現性が低く 11、ラテラルフローバンドは主に良好な検出に役立ちます 12、13。
マイクロおよびナノスケールでの製造能力の拡大により、定量測定用のマイクロ流体 POCT デバイスの開発の機会が生まれました 14、15、16、17。界面１８、１９の特性およびチャネル２０、２１、２２の幾何学的形状を調整することによって、これらのデバイスの毛管力および流量を制御することができる。しかし、その信頼性、特に湿潤性の高い液体に対する信頼性は、製造上の不正確さ、材料の欠陥、環境振動に対する敏感さのため、依然として許容できないものです。さらに、毛細管の流れが液体と気体の界面で生成されるため、特にマイクロ流体チャネルを液体で満たした後は、追加の流れを導入することができません。したがって、より複雑な検出には、サンプル注入のいくつかのステップを実行する必要があります 24,25。
マイクロ流体デバイスの中で、遠心式マイクロ流体デバイスは現在、POCT に最適なソリューションの 1 つです 26,27。駆動機構としては、回転速度を調整することで駆動力を制御できるという利点がある。ただし、遠心力が常にデバイスの外縁に向けられるため、より複雑な分析に必要な多段階反応の実装が困難になるという欠点があります。遠心力に加えて追加の駆動力（例えば、毛管２８、２９および他の多くの３０、３１、３２、３３、３４、３５）が多機能投与のために導入されるが、これらの追加の力は一般に命令であるため、予期しない液体移送が依然として発生する可能性がある。遠心力よりも小さいため、小さな動作範囲でのみ有効であるか、液体放出をオンデマンドで利用できません。遠心力学法 36、37、38、熱空気圧法 39、および能動的空気圧法 40 などの遠心マイクロ流体工学に空気圧操作を組み込むことは、魅力的な代替手段であることが証明されています。カウンターフゴダイナミックアプローチでは、追加のキャビティと接続マイクロチャネルが外部と内部の両方の動作のためにデバイスに統合されていますが、そのポンピング効率（75% ～ 90% の範囲）はポンピングサイクル数と粘度に大きく依存します。液体の。熱空気圧法では、ラテックス膜と流体移送チャンバーは、閉じ込められた空気量が加熱または冷却されたときに入口を密閉または再オープンするように特別に設計されています。ただし、加熱/冷却設定では応答が遅いという問題が発生し、熱感受性アッセイ (ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 増幅など) での使用が制限されます。アクティブな空気圧アプローチにより、正圧と高速モーターによる正確に一致した回転速度の同時適用により、オンデマンドのリリースと内側への移動が実現されます。空気圧アクチュエータ (正圧 41、42 または負圧 43) と常閉バルブ設計のみを使用して成功したアプローチは他にもあります。空気室内に圧力を連続的に加えることで、蠕動運動により液体を前方に送り出し、常閉バルブにより蠕動運動による液体の逆流を防ぎ、複雑な液体操作を実現します。しかし、現時点では、多機能の分注、オンデマンド放出、信頼性の高い性能、長期保存、高粘度液体の取り扱いなど、複雑な液体操作を単一の POCT デバイスで実行できるマイクロ流体技術は限られています。そしてコスト効率の高い製造。すべて同時に。マルチステップの機能操作が欠如していることも、これまでに Cepheid、Binx、Visby、Cobas Liat、Rhonda などの少数の商用 POCT 製品しか公開市場に導入できていない理由の 1 つである可能性があります。
本稿では、グリーンリングマイクロスイッチ技術（FAST）に基づく空気圧マイクロ流体アクチュエータを提案します。FAST は、マイクロリットルからミリリットルまでの幅広い試薬に必要なすべての特性を同時に組み合わせています。FAST は弾性膜、レバー、ブロックで構成されています。空気圧を加えずにメンブレン、レバー、ブロックをしっかりと閉めることができ、内部の液体を長期保存することができます。適切な圧力が加えられ、レバーの長さに調整されると、ダイヤフラムが拡張してレバーを開位置に押し、流体が通過できるようになります。これにより、カスケード、同時、順次、または選択的な方法での液体の多機能計量が可能になります。
当社は、FAST を使用して、インフルエンザ A および B ウイルス (IAV および IBV) を検出するためのサンプル内応答結果を生成する PCR システムを開発しました。102 コピー/mL の検出下限 (LOD) を達成し、マルチプレックス アッセイは IAV および IBV に対する特異性を示し、インフルエンザ ウイルスの病型判定を可能にしました。患者 18 名と健康な個人 18 名からの鼻腔スワブサンプルを使用した臨床検査結果は、蛍光強度が標準 RT-PCR と良好に一致していることを示しています (ピアソン係数 > 0.9)。患者 18 名と健康な個人 18 名からの鼻腔スワブサンプルを使用した臨床検査結果は、蛍光強度が標準 RT-PCR と良好に一致していることを示しています (ピアソン係数 > 0.9)。Результаты клинических испытаний с использованием образца мазка из носа от 18 пациентов и 18 здоровых лиц показыва ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9)。患者 18 名と健常人 18 名からの鼻腔スワブサンプルを使用した臨床試験の結果は、標準 RT-PCR の蛍光強度間の良好な一致を示しています (ピアソン係数 > 0.9)。0.9）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 豚olfeefeefhe冠式勝する虚偽窓の□暇なことわいことに至わかりに。患者18名と健康人18名からの鼻腔スワブ標本を使用した臨床試験の結果は、蛍光強度と標準RT-PCRとの間の良好な一致を示しました（ピアソン係数> 0.9）。FAST-POCT デバイスの推定材料費は約 1 米ドル (補足表 1) ですが、大規模な製造方法 (射出成形など) を使用することでさらに削減できます。実際、FAST ベースの POCT デバイスは、WHO によって義務付けられた必要な機能をすべて備えており、POCT システムのバックボーンである血漿熱サイクリング 44、無増幅イムノアッセイ 45、ナノボディ機能化試験 46 などの新しい生化学検査方法と互換性があります。可能性。
図上。図１ａは、ＦＡＳＴ－ＰＯＣＴプラットフォームの構造を示しており、これは４つの液体チャンバ、すなわち、予備貯蔵チャンバ、混合チャンバ、反応チャンバ、および廃棄チャンバで構成される。流体の流れ制御の鍵となるのは、予備保管チャンバーと混合チャンバーに配置された FAST 設計 (弾性膜、レバー、ブロックで構成) です。空気圧で作動する方法として、FAST 設計は、閉/開切り替え、多用途の投与、オンデマンドの流体放出、信頼性の高い動作 (環境振動に対する感度の低さなど)、および長期保管を含む正確な流体流量制御を提供します。FAST-POCTプラットフォームは、図1bの拡大図に示すように、バッキング層、弾性フィルム層、プラスチックフィルム層、カバー層の4つの層で構成されています（補足図S1およびS2にも詳細に示されています） ）。すべてのチャネルと流体輸送チャンバー (予備保管チャンバーや反応チャンバーなど) は、厚さ 0.2 mm (最薄部) から 5 mm の範囲の PLA (ポリ乳酸) 基板に埋め込まれています。弾性フィルム材料は厚さ 300 μm の PDMS であり、その「厚さ」と低弾性率（約 2.25 MPa47）により、空気圧が加わると容易に膨張します。ポリエチレンフィルム層は厚さ100μmのポリエチレンテレフタレート(PET)でできており、空気圧による過度の変形から弾性フィルムを保護します。チャンバーに対応して、基板層には、液体の流れを制御するためにヒンジによってカバー層 (PLA 製) に接続されたレバーがあります。弾性フィルムを両面接着テープ (ARseal 90880) を使用して裏打ち層に貼り付け、プラスチック フィルムで覆いました。カバー層の T クリップ設計を使用して、3 つの層を基板上に組み立てました。T クランプには 2 本の脚の間に隙間があります。クリップが溝に挿入されると、2本の脚がわずかに曲がり、溝を通過するときに元の状態に戻り、蓋と裏地をしっかりと結びました（補足図S1）。次に、コネクタを使用して 4 つの層が組み立てられます。
FAST のさまざまな機能コンパートメントと機能を示すプラットフォームの概略図。b FAST-POCT プラットフォームの拡大図。c 米国の 4 分の 1 ドル硬貨の隣にあるプラットフォームの写真。
FAST-POCT プラットフォームの動作メカニズムを図 2 に示します。主要なコンポーネントはベース層のブロックとカバー層のヒンジであり、4 つの層が T 字型を使用して組み立てられると干渉設計になります。 。空気圧がかかっていないとき（図 2a）、締まりばめによりヒンジが曲がり変形し、レバーを介してシール力が加えられ、弾性フィルムがブロックに押し付けられ、シールキャビティ内の液体が規定されます。密閉状態として。この状態では、図２ａの側面図に示すように、レバーが外側に曲がっていることに留意されたい。空気が供給されると（図2b）、弾性膜がカバーに向かって外側に拡張し、レバーを押し上げます。これにより、レバーとブロックの間に隙間が開き、流体が次のチャンバーに流れ込みます。この状態が開状態と定義されます。 。空気圧が解放されると、レバーは元の位置に戻り、ヒンジの弾性によりしっかりとした状態を維持します。レバーの動きのビデオは補足ムービー S1 で紹介されています。
A. 閉じた状態の概略図と写真。圧力がかかっていない状態では、レバーが膜をブロックに押し付け、液体が密閉されます。b 良好な状態。圧力がかかると膜が膨張してレバーを押し上げるため、チャネルが開き、流体が流れるようになります。c 臨界圧力の特性サイズを決定します。特徴的な寸法には、レバーの長さ (L)、スライダーとヒンジの間の距離 (l)、レバーの突起の厚さ (t) が含まれます。Fs はスロットル ポイント B での圧縮力です。q はレバーにかかる均一に分布した荷重です。Tx* は、ヒンジ付きレバーによって発生するトルクを表します。臨界圧力は、レバーを上げて流体を流すのに必要な圧力です。d 臨界圧力と要素サイズの関係の理論的および実験的結果。n = 6 回の独立した実験が実行され、データは±標準偏差として示されています。生データは生データ ファイルとして表示されます。
ギャップが開く臨界圧力 Pc の幾何学的パラメーターへの依存性を分析するために、ビーム理論に基づいた解析モデルが開発されました (たとえば、L はレバーの長さ、l はブロックとブロックの間の距離)ヒンジ、S はレバーです。液体との接触面積 t は、図 2c) に示すように、レバーの突起の厚さになります。補足ノートと補足図 S3 で詳しく説明されているように、ギャップは \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\) のときに開きます。ここで、Fs はトルクです\ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\) しまりばめに伴う力を排除し、ヒンジを曲げます。実験応答と解析モデルは良好な一致を示し（図2d）、t / lの増加とLの減少に伴って臨界圧力Pcが増加することを示しています。これは古典的なビームモデルによって簡単に説明できます。つまり、トルクはt / Liftに応じて増加します。 。したがって、私たちの理論分析は、レバーの長さ L と t/l 比を調整することで臨界圧力を効果的に制御できることを明確に示しており、これが FAST-POCT プラットフォームの設計に重要な基礎となります。
FAST-POCT プラットフォームは、多機能の分注 (図 3a の挿入図と実験を示す) を提供します。これは、POCT を成功させるための最も重要な特徴であり、液体を任意の方向および任意の順序 (カスケード、同時、順次) または選択的なマルチチャネルで流すことができます。調剤。– 投与機能。図上。図３ａ（ｉ）は、様々な反応物を分離するブロックと開閉状態を制御するレバーを使用して２つ以上のチャンバがカスケード接続されるカスケード投与モードを示す。圧力が加えられると、液体は上部チャンバーから下部チャンバーへカスケード状に流れます。カスケードチャンバーには湿式化学薬品または凍結乾燥粉末などの乾式化学薬品を充填できることに注意してください。図3a(i)の実験では、上部チャンバーからの赤色インクが青色染料粉末（硫酸銅）とともに2番目のチャンバーに流れ込み、下部チャンバーに到達すると濃い青色に変わります。ポンプで送られる流体の制御圧力も表示されます。同様に、1つのレバーを2つのチャンバーに接続すると、図のように同時注入モードになります。図３ａ（ｉｉ）では、圧力が加えられると、液体が２つ以上のチャンバに均一に分布することができる。臨界圧力はレバーの長さに依存するため、レバーの長さを調整して、図に示すような連続噴射パターンを実現できます。3a(iii)。長いレバー (臨界圧力 Pc_long) がチャンバー B に接続され、短いレバー (臨界圧力 Pc_short > Pc_long) がチャンバー A に接続されました。圧力 P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) が加えられると、赤色の液体のみが発生しました。青い液体はチャンバー B に流れることができ、圧力が P2 (> Pc_short) に増加すると、青い液体はチャンバー A に流れることができます。この連続注入モードは、関連するチャンバーに順番に移送されるさまざまな液体に適用されます。これは、POCT を成功させるために重要です。デバイス。長いレバー (臨界圧力 Pc_long) がチャンバー B に接続され、短いレバー (臨界圧力 Pc_short > Pc_long) がチャンバー A に接続されました。圧力 P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) が加えられると、赤色の液体のみが発生しました。青い液体はチャンバー B に流れることができ、圧力が P2 (> Pc_short) に増加すると、青い液体はチャンバー A に流れることができます。この連続注入モードは、関連するチャンバーに順番に移送されるさまざまな液体に適用されます。これは、POCT を成功させるために重要です。デバイス。Длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long) был соединен с камерой B, а короткий рычаг (с критическим давлением Pc_short >) был соединен с камерой A. При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) только жидкость, выделенная красным может течь в камеру B, и когда давление было увеличено до P2 (> Pc_short), сидкость может течь в камеру A. Этот режим последовательн ого впрыска применяется к различным жидкостям, последовательно перемещаемым в соответствующие камеры, что имееет POCT にアクセスしてください。長いレバー (臨界圧力 Pc_long) がチャンバー B に接続され、短いレバー (臨界圧力 Pc_short > Pc_long) がチャンバー A に接続されました。圧力 P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) が適用されると、液体のみが強調表示されます。赤色の液体がチャンバー B に流入し、圧力が P2 (> Pc_short) に上昇すると、青色の液体がチャンバー A に流入できます。この順次注入モードは、それぞれのチャンバーに順次移送される異なる流体に適用されます。これは重要です。 POCTの成功のために。デバイス。 Длинный рычаг (критическое давление Pc_long) соединен с камерой B, а короткий рычаг (критическое давление Pc_short > Pc_long) соединен с камерой A.長いアーム (臨界圧力 Pc_long) はチャンバー B に接続され、短いアーム (臨界圧力 Pc_short > Pc_long) はチャンバー A に接続されます。При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) в камеру B может поступать только красная жидкость, а при увеличении давления P2 (> Pc_short) が表示されます。圧力 P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) が適用されると、赤色の液体のみがチャンバー B に入ることができ、圧力が P2 (> Pc_short) に増加すると、青色の液体がチャンバー A に入ることができます。 この逐次注入モードは、液体を順次移送するのに適しています。これは、POCT デバイスの正常な動作にとって重要です。図 3a(iv) は選択噴射モードを示しています。メイン チャンバーには短いレバー (臨界圧力 Pc_short の場合) と長いレバー (臨界圧力 Pc_long < Pc_short の場合) があり、それぞれチャンバー A とチャンバー B に接続されています。液体をチャンバー A に移送するために、最初に圧力 P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) と P2 (P2 > P1) (P1 + P2 > Pc_short) を同時にデバイスに加えました。図 3a(iv) は選択噴射モードを示しています。メイン チャンバーには短いレバー (臨界圧力 Pc_short の場合) と長いレバー (臨界圧力 Pc_long < Pc_short の場合) があり、それぞれチャンバー A とチャンバー B に接続されています。液体をチャンバー A に移送するために、最初に圧力 P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) と P2 (P2 > P1) (P1 + P2 > Pc_short) を同時にデバイスに加えました。図上。3а(iv) показан режим селективного впрыска, при котором основная камера имела короткий (с критическим давлением Pc_short) и ный рычаг (с критическим давлением Pc_long < Pc_short)、которые дополнительно соединялись с камерой A и камерой B соответственно。図３ａ（ｉｖ）は選択噴射モードを示しており、メインチャンバは短いレバー（臨界圧力Ｐｃ＿ｓｈｏｒｔ）と長いレバー（臨界圧力Ｐｃ＿ｌｏｎｇ＜Ｐｃ＿ｓｈｏｒｔ）を有しており、これらはそれぞれチャンバＡとチャンバＢに追加的に接続されている。каналу, соединенному с камерой B. Чтобы сначала передать жидкость в камеру A, к устройству одновреме P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) および P2 (P2 > P1)、P1 + P2 > Pc_short です。最初に流体をチャンバー A に移送するために、圧力 P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) と P2 (P2 > P1) (P1 + P2 > Pc_short) がデバイスに同時に適用されました。 3а(iv) показан режим селективного впрыска, когда основная камера имеет короткий стержень (с критическим давлением Pc_short) и длинный стержень (с критическим давлением Pc_long < Pc_short), соединенные с камерой A и камерой B сответственно, и в дуполнение к гому воздузному каналу、 подключенному к комнате B.図３ａ（ｉｖ）は、メインチャンバーが、それぞれチャンバーＡおよびチャンバーＢに接続された短いステム（臨界圧力Ｐｃ＿ｓｈｏｒｔ）および長いステム（臨界圧力Ｐｃ＿ｌｏｎｇ＜Ｐｃ＿ｓｈｏｒｔ）を有し、さらに別の空気通路を有する場合の選択噴射モードを示し、部屋Bにつながっている.したがって、P2 は液体がチャンバー B に入るのを防ぎます。その間、全圧力 P1 + P2 が臨界圧力を超え、チャンバー A に接続された短いレバーが作動してチャンバー A に液体が流れるようになりました。その後、チャンバー B を充填する必要がある場合は、P1 (Pc_long <メインチャンバー内で P1 < Pc_short) になると、長いレバーが作動し、液体がチャンバー B に流れるようになります。時間 t = 3 秒から 9 秒まで、チャンバー A 内の液体が一定のままである一方で、チャンバー内で液体が増加していることがはっきりと観察できます。圧力 P1 を加えた場合は B。その間、全圧力 P1 + P2 が臨界圧力を超え、チャンバー A に接続された短いレバーが作動してチャンバー A に液体が流れるようになりました。その後、チャンバー B を充填する必要がある場合は、P1 (Pc_long <メインチャンバー内で P1 < Pc_short) になると、長いレバーが作動し、液体がチャンバー B に流れるようになります。時間 t = 3 秒から 9 秒まで、チャンバー A 内の液体が一定のままである一方で、チャンバー内で液体が増加していることがはっきりと観察できます。圧力 P1 を加えた場合は B。Между тем, общее давление P1 + P2 превысило критическое давление, чтобы активировать более короткий рычаг, соединенный с камерой A, чтобы позволить жидкости течь в камеру A. Затем, когда требуется заполнить камеру B, нам нужно только ть P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) ) в основной камере, чтобы активировать длинный рычаг и дать жидкости течь в камеру B. Можно ясно наблюдать, что в период с t = 3 с до 9 с жидкость в камере A оставалась постоянной, в то время как в камере она увеличивалась。一方、全圧力 P1 + P2 が臨界圧力を超えているため、チャンバー A に接続された短いレバーが作動して液体がチャンバー A に流入できるようになります。その後、チャンバー B を充填する必要がある場合は、P1 を適用するだけで済みます (Pc_long < P1) < Pc_short ) をメインチャンバーに加えて、長いレバーを作動させ、液体をチャンバー B に流します。 t = 3 秒から 9 秒の間、チャンバー A 内の液体は一定のままであるのに対し、チャンバー内の液体は増加していることがはっきりと観察できます。圧力 P1 を加えた場合は B。同時に、全圧力 P1 + P2 が臨界圧力を超え、チャンバー A に接続している短いレバーが作動し、流体がチャンバー A に流入できるようになります。チャンバー A を充填するときは、メイン チャンバーに P1 を適用し、二次チャンバーに P2 を適用するだけです。このようにして、カメラ A と B の間でフロー動作を選択的に切り替えることができます。4 つの多機能配信モードのフロー動作は補足ムービー S2 で確認できます。
a 多機能割り当て、つまり (i) カスケード割り当て、(ii) 同時割り当て、(iii) 順次割り当て、および (iv) 選択的割り当ての図。曲線は、これら 4 つの分散モードのワークフローとパラメーターを表します。b 脱イオン水とエタノール中での長期保存テストの結果。n = 5 の独立した実験が実行され、データは±sd c として示されています。FAST デバイスとキャピラリー バルブ (CV) デバイスが (i) 静的状態および (ii) 振動状態にあるときの安定性テストのデモンストレーション。(iii) さまざまな角周波数での FAST および CV デバイスの体積と時間の関係。d (i) FAST デバイスおよび (ii) CV デバイスのテスト結果をオンデマンドで公開します。(iii) 間欠圧力モードを使用した FAST デバイスと CV デバイスの体積と時間の関係。すべてのスケール バー、1 cm。生データは生データ ファイルとして提供されます。
試薬の長期保管は、訓練を受けていない担当者でも複数の試薬を扱えるようにする、成功した POCT 装置のもう 1 つの重要な特徴です。多くの技術が長期保存の可能性を示していますが（マイクロディスペンサー 35 個、ブリスターパック 48 個、スティックパック 49 個など）、パッケージを収容するには専用の受け取りコンパートメントが必要であり、コストと複雑さが増加します。さらに、これらの保管機構ではオンデマンドの分注ができず、パッケージ内の残り物による試薬の無駄が発生します。長期保存能力は、そのわずかな粗さとガス透過に対する耐性により、CNC 加工された PMMA 材料を使用して加速寿命試験を実施することによって検証されました (補足図 S5)。試験装置に脱イオン水 (脱イオン水) と 70% エタノール (揮発性試薬を模擬) を満たし、65℃で 9 日間放置しました。脱イオン水とエタノールは両方とも、上からのアクセスを防ぐためにアルミホイルを使用して保管されました。文献 50,51 で報告されているアレニウス方程式と浸透活性化エネルギーを使用して、リアルタイム相当量を計算しました。図上。図 3b は、65℃で 9 日間保存した 5 つのサンプルの平均重量損失結果を示しています。これは、23℃で 2 年間の脱イオン水の場合は 0.30%、70% エタノールの場合は 0.72% に相当します。
図上。３ｃは振動試験を示す。キャピラリーバルブ (CV) は既存の POCT28,29 デバイスの中で最も一般的な流体ハンドリング方法であるため、比較には幅 300 μm、深さ 200 μm の CV デバイスが使用されました。両方のデバイスが静止したままの場合、FAST-POCT プラットフォーム内の流体が密閉され、CV デバイス内の流体がチャネルの突然の拡張によりロックされ、毛細管力が減少することがわかります。ただし、軌道振動子の角周波数が増加すると、FAST-POCT プラットフォーム内の流体は密閉されたままになりますが、CV デバイス内の流体は下部チャンバーに流れ込みます (補足ムービー S3 も参照)。これは、FAST-POCT プラットフォームの変形可能なヒンジがモジュールに強い機械力を加えて、チャンバー内の液体をしっかりと密閉できることを示唆しています。しかし、CV 装置では、固相、空気相、液相のバランスにより液体が保持されるため不安定になり、振動によりバランスが崩れ、予期せぬ流動挙動を引き起こす可能性があります。FAST-POCT プラットフォームの利点は、信頼性の高い機能を提供し、配送中や操作中に通常発生する振動による障害を回避できることです。
FAST-POCT プラットフォームのもう 1 つの重要な特徴は、定量分析の重要な要件であるオンデマンド リリースです。図上。3D は、FAST-POCT プラットフォームのオンデマンド リリースと CV デバイスを比較します。図から。3d(iii) では、FAST デバイスが圧力信号に迅速に応答することがわかります。FAST-POCT プラットフォームに圧力を加えると流体が流れ、圧力を解放すると流れはすぐに止まりました (図 3d(i))。この動作は、ヒンジが弾性的に素早く戻り、レバーをブロックに押し付けてチャンバーを閉じることで説明できます。ただし、CV デバイス内では流体が流れ続け、最終的に圧力が解放された後、予期しない流体量が約 100 μl になりました (図 3d(ii) および補足ムービー S4)。これは、最初の注入後に CV が完全に濡れると毛細管ピンニング効果が消失することで説明できます。
POCT アプリケーションでは、湿潤性と粘度が異なる液体を同じデバイス内で処理できるかどうかが依然として課題となっています。湿潤性が低いと、チャネル内での漏れやその他の予期しない流れの挙動が発生する可能性があり、高粘度の液体を調製するには、ボルテックスミキサー、遠心分離機、フィルターなどの補助装置が必要になることがよくあります 52。私たちは、臨界圧力と流体特性 (広範囲の濡れ性と粘度) の関係をテストしました。結果を表 1 およびビデオ S5 に示します。濡れ性や粘度の異なる液体をチャンバー内に封入でき、圧力を加えると粘度が5500cPまでの液体でも隣のチャンバーに移送でき、高精度なサンプルの検出が可能であることがわかります。粘度（すなわち、喀痰、呼吸器疾患の診断に使用される非常に粘性の高いサンプル）。
上記の多機能分注デバイスを組み合わせることで、幅広い FAST ベースの POCT デバイスを開発できます。例を図 1 に示します。プラントには、予備保管チャンバー、混合チャンバー、反応チャンバー、および廃棄チャンバーが含まれています。試薬は事前保管チャンバーに長期間保管され、その後混合チャンバーに排出される場合があります。適切な圧力を使用すると、混合反応物を選択的に廃棄チャンバーまたは反応チャンバーに移送できます。
PCR 検出は H1N1 や COVID-19 などの病原体を検出するためのゴールドスタンダードであり、複数の反応ステップが必要となるため、アプリケーションとして PCR 検出用の FAST-POCT プラットフォームを使用しました。図上。図4は、FAST-POCTプラットフォームを使用したPCR検査プロセスを示しています。まず、溶出試薬、磁性マイクロビーズ試薬、洗浄溶液 A、および洗浄溶液 W をそれぞれ予備保管チャンバー E、M、W1、および W2 にピペットで移しました。RNA 吸着の段階を図に示します。(1) 圧力 P1 (=0.26 bar) が加えられると、サンプルはチャンバー M に移動し、混合チャンバーに排出されます。(2) 混合チャンバーの底部に接続されたポート A を通じて空気圧 P2 (= 0.12 bar) が供給されます。多くの混合方法が POCT プラットフォームでの液体の混合における可能性を示していますが (例えば、サーペンタイン混合 53、ランダム混合 54、バッチ混合 55)、それらの混合効率と有効性はまだ満足のいくものではありません。混合室の底部に空気を導入して液中に気泡を発生させ、強力な渦により数秒以内に完全に混合する気泡混合方式を採用しています。気泡混合実験が実施され、その結果が補足図S6に示されています。0.10 bar の圧力を加えると、完全な混合には約 8 秒かかることがわかります。圧力を 0.20 bar まで高めると、約 2 秒で完全な混合が達成されます。混合効率を計算する方法は、「方法」セクションに記載されています。(3) ルビジウム磁石を使用してビーズを抽出し、ポート P を通じて P3 (= 0.17 bar) を加圧して試薬を廃棄チャンバーに移動します。図上。図４ｂ、ｃは、以下のようにサンプルから不純物を除去するための洗浄ステップを示す。（１）洗浄溶液ＡがチャンバＷ１から圧力混合チャンバＰ１に排出される。(2) 次に泡を混ぜる工程を行います。(3) 洗浄液 A を廃液室に移送し、混合室内のマイクロビーズを磁石により引き抜きます。洗浄 W (図 4c) は洗浄 A (図 4b) と同様でした。なお、洗浄工程Ａ、Ｗは２回ずつ行った。図 4d は、ビーズから RNA を溶出する溶出ステップを示しています。溶出および混合導入ステップは、上記の RNA 吸着および洗浄ステップと同じです。溶出試薬が圧力 P3 および P4 (=0.23 bar) で PCR 反応チャンバーに移送されると、PCR 反応チャンバーのアームが密閉される臨界圧力に達します。同様に、P4 圧力も廃棄物チャンバーへの通路を密閉するのに役立ちます。したがって、すべての溶出試薬が 4 つの PCR 反応チャンバーに均等に分配され、マルチプレックス PCR 反応が開始されました。上記の手順は補足ムービー S6 に示されています。
ＲＮＡ吸着ステップでは、サンプルが入口Ｍに導入され、予め保管されていたビーズ溶液とともに混合チャンバーに注入される。混合して顆粒を除去した後、試薬は廃棄チャンバーに分配されます。bおよびcの洗浄ステップでは、あらかじめ保存しておいた各種洗浄試薬を混合チャンバーに導入し、混合してビーズを除去した後、試薬を廃液チャンバーに移送します。d 溶出ステップ: 溶出試薬の導入、混合、ビーズ抽出後、試薬は PCR 反応チャンバーに移されます。曲線は、ワークフローとさまざまなステージの関連パラメーターを示します。圧力は、個々のチャンバーを通して加えられる圧力です。体積は、混合チャンバー内の液体の体積です。スケール バーはすべて 1 cm です。生データは生データ ファイルとして提供されます。
PCR テスト手順が実行され、補足図 S7 は、20 分の逆転写時間と 60 分の熱サイクル時間 (95 および 60 °C) を含む熱プロファイルを示しています。1 つの熱サイクルは 90 秒です (補足ムービー S7)。。FAST-POCT は、1 つの熱サイクルを完了するのに必要な時間 (90 秒) が、従来の RT-PCR (1 つの熱サイクルで 180 秒) よりも短くなります。これは、マイクロ PCR 反応チャンバーの体積に対する表面積の比率が高く、熱慣性が低いため説明できます。チャンバー表面積は 96.6 mm2、チャンバー容積は 25 mm3 で、表面積と容積の比は約 3.86 になります。補足図S10に見られるように、私たちのプラットフォームのPCRテストエリアにはバックパネルに溝があり、PCRチャンバーの底の厚さは200μmになっています。温度コントローラーの加熱面には熱伝導性の弾性パッドが取り付けられており、テストボックスの背面に密着します。これにより、プラットフォームの熱慣性が低減され、加熱/冷却効率が向上します。熱サイクル中、プラットフォームに埋め込まれたパラフィンが溶けて PCR 反応チャンバーに流れ込み、試薬の蒸発や環境汚染を防ぐシーラントとして機能します (補足ムービー S8 を参照)。
上記のすべての PCR 検出プロセスは、プログラムされた圧力制御ユニット、磁気抽出ユニット、温度制御ユニット、蛍光シグナル捕捉および処理ユニットで構成されるカスタムメイドの FAST-POCT 装置を使用して完全に自動化されました。注目すべきことに、RNA 単離には FAST-POCT プラットフォームを使用し、比較のために FAST-POCT システムとデスクトップ PCR システムを使用した PCR 反応には抽出した RNA サンプルを使用しました。結果は、補足図S8に示すものとほぼ同じでした。オペレーターは簡単な作業を実行します。サンプルを M チャンバーに導入し、プラットフォームを装置に挿入します。定量的な検査結果は約 82 分で得られます。FAST-POCT ツールの詳細については、補足図を参照してください。C9、C10、C11。
インフルエンザ A (IAV)、B (IBV)、C (ICV)、および D (IDV) ウイルスによって引き起こされるインフルエンザは、世界的に共通の現象です。このうち、IAVとIBVは最も重篤な症例と季節性の流行の原因となっており、世界人口の5～15%が感染し、年間300万～500万人の重症患者を引き起こし、29万～65万人の死亡を引き起こしています。呼吸器疾患56,57。IAV および IB の早期診断は、罹患率とそれに伴う経済的負担を軽減するために不可欠です。利用可能な診断技術の中で、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) が最も感度が高く、特異的で正確 (>99%) であると考えられています 58,59。利用可能な診断技術の中で、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) が最も感度が高く、特異的で正確 (>99%) であると考えられています 58,59。Среди доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) я наиболее чувствительной、специфичной и точной (> 99%)58,59。利用可能な診断方法の中で、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) が最も感度が高く、特異的で正確 (> 99%) であると考えられています 58,59。 Из доступных диагностических методов полимеразная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) считается аиболее чувствительной、специфичной и точной (>99%)58,59。利用可能な診断方法の中で、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) が最も感度が高く、特異的で正確 (>99%) であると考えられています 58,59。しかし、従来の RT-PCR 法では、液体のピペッティング、混合、分注、移送を繰り返す必要があり、リソースが限られた環境で専門家による使用が制限されていました。ここでは、FAST-POCT プラットフォームをそれぞれ IAV と IBV の PCR 検出に使用して、検出下限 (LOD) を取得しました。さらに、IAV と IBV は種を超えて異なる病型を区別するために多重化されており、遺伝子解析と疾患を正確に治療する能力に有望なプラットフォームを提供しています。
図上。図５ａは、サンプルとして１５０μｌの精製ウイルスＲＮＡを使用したＨＡＶ ＰＣＲ試験の結果を示す。図上。5a(i) は、106 コピー/ml の HAV 濃度で蛍光強度 (ΔRn) が 0.830 に達する可能性があり、濃度が 102 コピー/ml に低下しても、ΔRn が依然として 0.365 に達する可能性があることを示しており、これはそれよりも高い値に相当します。空のネガティブ コントロール グループ (0.002) の約 100 倍です。6 つの独立した実験に基づく定量化のために、IAV の対数濃度とサイクル閾値 (Ct) の間で直線検量線を作成しました (図 5a(ii))、R2 = 0.993、102 〜 106 コピー/mL の範囲です。結果は従来の RT-PCR 法とよく一致しています。図上。図５ａ（ｉｉｉ）は、ＦＡＳＴ－ＰＯＣＴプラットフォームの４０サイクル後の試験結果の蛍光画像を示す。FAST-POCT プラットフォームは 102 コピー/mL の HAV を検出できることがわかりました。ただし、従来の方法では Ct 値が 102 コピー/mL にならず、LOD は約 103 コピー/mL になります。私たちは、これは気泡の混合効率が高いためではないかと仮説を立てました。精製された IAV RNA に対して PCR テスト実験を実行し、振盪混合 (従来の RT-PCR 操作と同じ混合方法)、バイアル混合 (この方法、0.12 bar で 3 秒)、および対照グループとして混合なしを含むさまざまな混合方法を評価しました。 。。結果は補足図S12に示されています。より高い RNA 濃度 (106 コピー/mL) では、さまざまな混合方法の Ct 値がバブル混合の場合とほぼ同じであることがわかります。RNA 濃度が 102 コピー/mL に低下したとき、シェイク ミックスとコントロールには Ct 値がありませんでしたが、バブル ミックス法では依然として Ct 値 36.9 が得られ、これは Ct 閾値の 38 を下回りました。結果は、支配的な混合特性を示しています。これは他の文献でも実証されており、FAST-POCT プラットフォームの感度が従来の RT-PCR よりわずかに高い理由も説明できる可能性があります。図上。図５ｂは、１０１〜１０６コピー／ｍｌの範囲の精製されたＩＢＶ ＲＮＡサンプルのＰＣＲ分析の結果を示す。結果は IAV テストと同様で、R2 = 0.994、LOD 102 コピー/mL を達成しました。
TE バッファーをネガティブコントロール (NC) として使用した、106 ～ 101 コピー/mL の範囲の IAV 濃度でのインフルエンザ A ウイルス (IAV) の PCR 分析。(i) リアルタイム蛍光曲線。(ii) FAST および従来の検査法の対数 IAV RNA 濃度とサイクル閾値 (Ct) の間の直線検量線。(iii) 40 サイクル後の IAV FAST-POCT 蛍光画像。b、(i) リアルタイム蛍光スペクトルによる B 型インフルエンザウイルス (IBV) の PCR 検出。(ii) 直線検量線および (iii) 40 サイクル後の FAST-POCT IBV 蛍光画像。FAST-POCT プラットフォームを使用した IAV および IBV の検出下限 (LOD) は 102 コピー/mL であり、従来の方法 (103 コピー/mL) よりも低かった。c IAV および IBV の多重テスト結果。可能性のある汚染およびバックグラウンド増幅を防ぐために、GAPDH をポジティブコントロールとして使用し、TE バッファーをネガティブコントロールとして使用しました。4 つの異なるサンプル タイプを区別できます。(1) GAPDH のみの陰性サンプル (「IAV-/IBV-」)。(2) IAVおよびGAPDHによるIAV感染(「IAV+/IBV-」)。(3) IBVおよびGAPDHによるIBV感染(「IAV-/IBV+」)。（４）ＩＡＶ、ＩＢＶおよびＧＡＰＤＨによるＩＡＶ／ＩＢＶ感染（「ＩＡＶ＋／ＩＢＶ＋」）。点線は閾値ラインを表します。n = 6 の生物学的に独立した実験が行われ、データは±標準偏差として示されています。生データは生データ ファイルとして表示されます。
図上。図５ｃは、ＩＡＶ／ＩＢＶの多重化テストの結果を示す。ここでは、精製 RNA の代わりにウイルス ライセートをサンプル溶液として使用し、IAV、IBV、GAPDH (ポジティブ コントロール)、および TE バッファー (ネガティブ コントロール) の 4 つのプライマーを FAST-POCT プラットフォームの 4 つの異なる反応チャンバーに追加しました。ここでは、汚染の可能性やバックグラウンドの強調を防ぐために、ポジティブコントロールとネガティブコントロールが使用されます。検査は 4 つのグループに分けられました。(1) GAPDH 陰性サンプル (「IAV-/IBV-」)。(2) IAV 感染 (「IAV+/IBV-」) 対 IAV および GAPDH。(3)IBV-。感染した (「IAV-」) -/IBV+」) IBV および GAPDH。（４）ＩＡＶ／ＩＢＶ（「ＩＡＶ＋／ＩＢＶ＋」）、ＩＡＶ、ＩＢＶおよびＧＡＰＤＨによる感染。図上。図５ｃは、陰性サンプルを適用した場合、陽性対照チャンバーの蛍光強度ΔＲｎが０．８６０であり、ＩＡＶおよびＩＢＶのΔＲｎが陰性対照（０．００２）と同様であったことを示す。IAV+/IBV-、IAV-/IBV+、および IAV+/IBV+ グループでは、IAV/GAPDH、IBV/GAPDH、および IAV/IBV/GAPDH カメラがそれぞれ顕著な蛍光強度を示しましたが、他のカメラはバックグラウンドでも蛍光強度を示しました。熱サイクル後のレベルは 40。上記のテストから、FAST-POCT プラットフォームは優れた特異性を示し、さまざまなインフルエンザ ウイルスの病型を同時に識別できることがわかりました。
FAST-POCTの臨床応用性を検証するために、IB患者（n = 18）および非IB対照（n = 18）からの36の臨床検体（鼻ぬぐい検体）をテストしました（図6a）。患者情報は補足表3に示されています。IB感染状態は独自に確認され、研究プロトコールは浙江大学第一付属病院（浙江省杭州）によって承認されました。患者の各サンプルは 2 つのカテゴリーに分類されました。1 つは FAST-POCT を使用して処理し、もう 1 つはデスクトップ PCR システム (SLAN-96P、中国) を使用して処理しました。どちらのアッセイでも同じ精製キットと検出キットを使用します。図上。図６ｂは、ＦＡＳＴ－ＰＯＣＴおよび従来の逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）の結果を示す。蛍光強度 (FAST-POCT) を -log2(Ct) と比較しました。ここで、Ct は従来の RT-PCR のサイクル閾値です。2 つの方法の間には良好な一致がありました。FAST-POCT および RT-PCR は、ピアソン比 (r) 値 0.90 の強い正の相関を示しました (図 6b)。次に、FAST-POCT の診断精度を評価しました。陽性サンプルと陰性サンプルの蛍光強度（FL）分布は、独立した分析尺度として提供されました（図6c）。FL 値は、対照よりも IB 患者の方が有意に高かった (****P = 3.31 × 10-19; 両側 t 検定) (図 6d)。次に、IBV 受信機動作特性 (ROC) 曲線がプロットされました。診断精度は非常に良好であり、曲線下面積は 1 であることがわかりました (図 6e)。2020年現在、中国では新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の影響でマスクの注文が義務付けられているため、IBD患者は特定されていないため、陽性の臨床検体（鼻腔ぬぐい液検体）はすべてIBVのみのものであったことにご注意ください。
臨床研究のデザイン。18 の患者サンプルと 18 の非インフルエンザ対照を含む合計 36 のサンプルを、FAST-POCT プラットフォームと従来の RT-PCR を使用して分析しました。b FAST-POCT PCR と従来の RT-PCR の間の分析的一貫性を評価します。結果は正の相関がありました (ピアソン r = 0.90)。c 18 人の IB 患者と 18 人の対照における蛍光強度レベル。d IB患者（+）では、FL値が対照群（-）よりも有意に高かった（****P = 3.31×10-19;両側t検定; n = 36）。各正方形のプロットでは、中央の黒いマーカーが中央値を表し、ボックスの下の線と上の線がそれぞれ 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルを表します。ひげは最小および最大のデータ ポイントまで伸びていますが、これらは外れ値とはみなされません。e ROC 曲線。点線 d は ROC 解析から推定された閾値を表します。IBV の AUC は 1 です。生データは生データ ファイルとして提供されます。
本稿では、理想的なPOCTに求められる特性を備えたFASTについて紹介します。当社の技術の利点は次のとおりです。 (1) 多用途の投与 (カスケード、同時、順次、選択)、オンデマンドでの放出 (加えられた圧力の迅速かつ比例的な解放)、および信頼性の高い動作 (150 度の振動) (2) 長期保管(2 年間の加速試験、約 0.3% の重量減少)。(3) 広範囲の湿潤性と粘度 (最大 5500 cP の粘度) の液体を扱う能力。(4) 経済的 (FAST-POCT PCR 装置の推定材料費は約 1 米ドル)。多機能ディスペンサーを組み合わせることで、インフルエンザ A 型および B 型ウイルスの PCR 検出用の統合 FAST-POCT プラットフォームが実証され、適用されました。FAST-POCT にはわずか 82 分かかります。36 個の鼻腔スワブサンプルを用いた臨床試験では、蛍光強度が標準 RT-PCR と良好に一致していることが示されました (ピアソン係数 > 0.9)。36 個の鼻腔スワブサンプルを用いた臨床試験では、蛍光強度が標準 RT-PCR と良好に一致していることが示されました (ピアソン係数 > 0.9)。Клинические тесты с 36 образцами мазков из носа показали хорозее соответствие интенсивности флуоресценции стандартнии ой ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9)。36 個の鼻腔スワブサンプルを用いた臨床試験では、標準 RT-PCR の蛍光強度と良好な一致が示されました (ピアソン係数 > 0.9)。RT-PCR Клинические испытания 36 образцов мазков из носа показали хорозее совпадение интенсивности флуоресценции стандар тной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9)。36 個の鼻腔スワブ標本の臨床検査では、標準的な RT-PCR と蛍光強度がよく一致することが示されました (ピアソン係数 > 0.9)。この研究と並行して、さまざまな新たな生化学的方法（例えば、血漿熱サイクリング、増幅を必要としないイムノアッセイ、およびナノボディ機能化アッセイ）が、POCT における可能性を示しています。しかし、完全に統合された堅牢な POCT プラットフォームがないため、これらの方法では必然的に個別の前処理手順 (例、RNA 単離 44、インキュベーション 45、洗浄 46) が必要になります。これにより、これらの方法による現在の研究をさらに補完して、高度な POCT 機能を実装できます。必要なパラメータ。応答出力でのフェッチのパフォーマンス。この研究では、FAST バルブの作動に使用されるエア ポンプはベンチトップ機器に統合できるほど小型ですが (図 S9、S10)、それでもかなりの電力を消費し、ノイズが発生します。原理的には、より小さなフォームファクターの空気圧ポンプは、電磁力やフィンガー作動の使用などの他の手段で置き換えることができます。さらなる改善には、例えば、加熱/冷却システムを必要としない新しい検出方法を使用して、異なる特定の生化学アッセイにキットを適合させることが含まれ、これにより、PCR アプリケーションにツール不要の POCT プラットフォームが提供されます。FAST プラットフォームが液体を操作する方法を提供することを考えると、提案されている FAST 技術は、生物医学検査だけでなく、環境モニタリング、食品品質検査、材料および医薬品合成のための共通プラットフォームを作成する可能性を秘めていると考えています。 。。
人間の鼻腔綿棒標本の収集と使用は、浙江大学第一付属病院の倫理委員会によって承認されています (IIT20220330B)。30 歳未満の成人 16 名、40 歳以上の成人 7 名、男性 19 名、女性 17 名を含む 36 件の鼻腔スワブサンプルが収集されました。30 歳未満の成人 16 名、40 歳以上の成人 7 名、男性 19 名、女性 17 名を含む 36 件の鼻腔スワブサンプルが収集されました。Было собрано 36 образцов мазков из носа, в которых приняли участие 16 взрослых < 30 лет, 7 взрослых старгее 40 лет, мужчин и 17 женщин.30歳未満の成人16人、40歳以上の成人7人、男性19人、女性17人から36個の鼻腔スワブ標本を収集した。.人口統計データは補足表 3 に示されています。すべての参加者からインフォームドコンセントが得られました。参加者全員にインフルエンザの疑いがあり、無償で自主的に検査を受けた。
FAST のベースと蓋はポリ乳酸 (PLA) で作られており、Ender 3 Pro 3D プリンター (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.) で印刷されています。両面テープは Adhesives Research, Inc. から購入したモデル 90880 です。厚さ 100 μm の PET フィルムは McMaster-Carr から購入しました。接着剤と PET フィルムの両方を、Silhouette America, Inc. の Silhouette Cameo 2 カッターを使用して切断しました。弾性フィルムは、射出成形によって PDMS 材料で作られています。まず、厚さ 200 μm の PET フレームをレーザー システムを使用して切断し、100 μm の両面粘着テープを使用して厚さ 3 mm の PMMA シートに貼り付けました。次いで、ＰＤＭＳ前駆体（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４；パートＡ：パートＢ＝１０：１、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を型に注ぎ、ガラス棒を使用して過剰なＰＤＭＳを除去した。７０℃で３時間硬化させた後、厚さ３００μｍのＰＤＭＳフィルムを型から剥がすことができた。
多用途の配信、オンデマンド公開、信頼性の高いパフォーマンスのための写真は、高速カメラ (Sony AX700 1000 fps) で撮影されています。信頼性試験に使用したオービタルシェーカーはSCILOGEX社製（SCI-O180）を購入しました。空気圧はエアコンプレッサーによって生成され、圧力値を調整するために複数のデジタル精密圧力調整器が使用されます。フロー動作テストのプロセスは次のとおりです。所定量の流体が試験装置に注入され、高速カメラを使用して流れの挙動が記録されました。次に、一定時間の流れの挙動のビデオから静止画像を取得し、Image-Pro Plus ソフトウェアを使用して残りの面積を計算し、カメラの深度を乗算して体積を計算しました。流れ挙動試験システムの詳細は、補足図S4にあります。
50 μl のマイクロビーズと 100 μl の脱イオン水をバイアル混合装置に注入します。混合パフォーマンス写真は、0.1 bar、0.15 bar、0.2 bar の圧力で高速カメラを使用して 0.1 秒ごとに撮影されました。ブレンディング処理中のピクセル情報は、写真処理ソフトウェア (Photoshop CS6) を使用してこれらの画像から取得できます。また、混合効率は次の式 53 で求めることができます。
ここで、M は混合効率、N はサンプル ピクセルの総数、ci と \(\bar{c}\) は正規化された濃度と期待される正規化された濃度です。混合効率の範囲は 0 (0%、未混合) ～ 1 (100%、完全に混合) です。結果を補足図S6に示します。
IAV および IBV 用リアルタイム RT-PCR キット (IAV および IBV RNA サンプルを含む) (カタログ番号 RR-0051-02/RR-0052-02、Liferiver、中国)、Tris-EDTA バッファー (TE バッファー no. B541019) 、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、中国）、ポジティブコントロールＲＮＡ精製キット（部品番号Ｚ－ＭＥ－００１０、Ｌｉｆｅｒｉｖｅｒ、中国）およびＧＡＰＤＨ溶液（部品番号Ｍ５９１１０１、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、中国）が市販されている。RNA 精製キットには、結合バッファー、洗浄液 A、洗浄液 W、溶離液、磁性マイクロビーズ、アクリル担体が含まれています。IAV および IBV リアルタイム RT-PCR キットには、IFVA 核酸 PCR 検出ミックスと RT-PCR 酵素が含まれています。500 μl の結合緩衝液に 6 μl の AcrylCarrier と 20 μl の磁気ビーズを加え、よく振った後、ビーズ溶液を調製します。洗浄液 A および W にエタノール 21 ml を加え、よく振って洗浄液 A および W の溶液をそれぞれ得ます。次に、IFVA核酸を含む蛍光PCR混合物18μlおよびRT-PCR酵素1μlをTE溶液1μlに添加し、数秒間振盪および遠心分離し、IAVおよびIBVプライマー20μlを得た。
以下の RNA 精製手順に従ってください: (1) RNA の吸着。526 μl のペレット溶液をピペットで 1.5 ml 遠心管に移し、150 μl のサンプルを加え、手動でチューブを上下に 10 回振ります。混合物 676 µl をアフィニティーカラムに移し、1.88 x 104 g で 60 秒間遠心分離します。その後のドレンは廃棄されます。(2) 洗浄の第一段階。500 μl の洗浄溶液 A をアフィニティーカラムに加え、1.88 x 104 g で 40 秒間遠心分離し、使用済みの溶液を廃棄します。この洗浄工程を２回繰り返した。(3) 洗浄の第 2 段階。500 μl の洗浄溶液 W をアフィニティーカラムに加え、1.88 x 104 g で 15 秒間遠心分離し、使用済みの溶液を廃棄します。この洗浄工程を２回繰り返した。(4) 溶出。200 μl の溶出液をアフィニティーカラムに加え、1.88 x 104 g で 2 分間遠心分離します。（５）ＲＴ－ＰＣＲ：ＰＣＲチューブ中のプライマー溶液２０μｌに溶出液を注入し、リアルタイムＰＣＲ検査装置（ＳＬＡＮ－９６Ｐ）にセットしてＲＴ－ＰＣＲ処理を行った。検出プロセス全体には約 140 分かかります (RNA 精製には 20 分、PCR 検出には 120 分)。
ビーズ溶液 526μl、洗浄液 A 1000μl、洗浄液 W 1000μl、溶出液 200μl、プライマー溶液 20μl をあらかじめ添加し、チャンバー M、W1、W2、E および PCR 検出チャンバーに保管しました。プラットフォームの組み立て。次に、サンプル 150 μl をピペットでチャンバー M に移し、FAST-POCT プラットフォームを補足図 S9 に示す検査機器に挿入しました。約82分後、検査結果が得られました。
特に明記しない限り、すべての試験結果は、FAST-POCT プラットフォームと生物学的に独立したサンプルのみを使用して最低 6 回反復した後の平均 ± SD として表示されます。分析から除外されたデータはありません。実験はランダムではありません。研究者らは実験中、グループ課題について盲目的だったわけではない。
研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの要約を参照してください。
この研究の結果を裏付けるデータは補足情報で入手できます。この記事では元のデータを提供します。
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